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脉冲紫外光对流动态牛奶中金黄色葡萄球菌的杀灭处理

UV材料

脉冲紫外光对流动态牛奶中金黄色葡萄球菌的杀灭处理

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脉冲紫外光对流动态牛奶中金黄色葡萄球菌的杀灭处理

K. KRISHNAMURTHY, A. DEMIRCI, AND J.M. IRUDAYARAJ

摘要:本文研究脉冲紫外光对流动态牛奶中金黄色葡萄球菌的杀灭,此种病原性微生物常出现在牛奶中,与牛奶安全性有关。脉冲强光是一种新型杀菌技术,在很短时间内能杀灭牛奶中病原体。脉冲紫外光损害菌体的DNA,在辐射DNA上形成胸腺嘧啶二聚体导致病原体死亡。影响杀菌效果的因素有:紫外光源离石英板的距离,闪照次数和液体流量。用响应曲面法对实验进行设计和分析。牛奶放置在距离光源5cm8cm11cm处,流量控制在20ml/min,30 ml/min和40 ml/min循环处理三次,评估各种变量对杀菌效果的影响。菌体减少量变化为0.55-7.26 log10 cfu/ml。第二个实验数据得到菌体已被完全杀灭,这与别的研究者得到数据相同。综上所述,脉冲紫外光很有可能应用到牛奶病原体的灭菌中。

关键词:牛奶巴氏杀菌;病原体灭活;脉冲紫外光;金黄色葡萄球菌

材料和方法

接种

金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)来自于宾夕法尼亚州立大学食品微生物菌种保藏中心,菌体接在胰蛋白酶大豆琼脂斜面(TSADifcoSparksMd., U.S.A.),放置在4保藏。菌体接种在150ml无菌胰蛋白酶大豆肉汤培养基中,放在37℃孵化箱中孵化24h,放在离心机中离心3300×g,25min4℃,弃去上清液收集菌体。

牛奶来自于宾夕法尼亚州立大学农学院或直接从农场购得,将其贮藏在4℃,最多保藏3天。离心后的菌体溶解在100ml原奶中,用涡旋混合仪震荡均匀,使里面菌体含量达到8-9 log10 cfu/ml。

研究所用牛奶要确保此牛奶是标准奶或无均质奶。实验操作会改变牛奶成分,包括牛奶中脂质含量,它可能会影响病原体的灭活。众所周知脂肪对病原体具有保护作用,因此,原料中丰富的脂肪模拟最差实验环境。天然牛奶中的金黄色葡萄球菌计算到了初始菌体中。

实验设计

用响应曲面法对实验进行设计,计算出不同变量下如:样品距离光源距离(5cm-11cm),闪照次数和不同流量(20ml/min-40ml/min)下循环闪照三次(表1)时菌体的减少量。

1 Box-Behnken响应曲面设计参数

变量

最小值

最大值

距离a

5cm

11cm

次数

1

3

流量

20 ml/min

40 ml/min

 

a石英板距离UV闪照灯中心距离为5.8cm

脉冲紫外光闪照处理

SteriPulseR-XL 3000脉冲杀菌系统对样品进行闪照处理,该系统激发光谱波长为100nm-1100nm54%的光能量集中在紫外光区域内。系统闪照频率为3HZ,距离石英板1.8cm处时,单次辐射能量1.27 J/cm2,单次输出电压3800V。石英板距离灯管5.8cm。流量系统如图1所示,用流量泵将含有金黄色葡萄球菌牛奶抽到石英玻璃管中进行辐射处理。脉冲光辐射石英管只有28cm长,其余管道用铝箔纸覆盖,避免紫外光辐射。另外,V型槽反光托盘装置,用来支撑石英玻璃管和改变紫外线方向。此外,V型槽反光面能聚集能量,使石英管内流动牛奶吸收更多能量。如图2所示反光面之间的角度值大约为56°117°反射板的狭窄通道用以支撑石英管,反射板的上部比较平滑,减少灯光的阴影效应。反光板V型槽是由脉冲紫外光系统公司设计,根据实验结果得到最大紫外光吸收量。

 

牛奶连续处理示意图

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1牛奶连续处理示意图

角度具有重要的作用,它决定反射到样品中能量的多少。典型的ellipticalshaped反光板将所有能量都聚集在样品中。进一步研究V型反光槽,目的是为了让反光达到最佳效果。石英管的中心轴与脉冲紫外光灯对齐,确保样品最大限度的吸收能量。接收容器向上升高了47cm,减少抽提过程中形成泡沫。根据表面反应设计,牛奶可以进行三次循环处理。牛奶多次通过泵循环处理,可以避免未处理牛奶存在。然后从实际处理处移去未处理牛奶,Presterilized容器用以收集每次处理过的样品。

冲处理室V型槽反光板

2脉冲处理室V型槽反光板

测量温度

连接数据记录仪的Ktype型热电偶温度计对牛奶进行温度测定。热电偶立即插到脉冲紫外光系统的外部,测量样品进料口和出料口的温度,进料口和出料口的距离相等。用热电偶测量脉冲光处理后的均质牛奶,确保测量温度为整体牛奶温度。热电偶和温度计在每次使用前后,都要对其进行消毒杀菌处理。

微生物分析

脉冲处理前后金黄色葡萄球菌的计数。1ml样品液用0.1%无菌蛋白胨水溶液进行梯度稀释,用AutoplateR4000型仪器将菌液涂布于Baird-Parker琼脂培养基中。涂布好的平板放置在37℃中孵化24hQ-CountTM 对平板上的菌体进行计数。用log10计算未处理样品和处理样品中菌体的平均值。将1ml脉冲光处理浓缩样品转移到9ml无菌TSB中,置于37℃中培养24h-48h。对于数量较少或者没有菌体金黄色葡萄球菌的样品处理液,涂布于Baird-Parker琼脂培养基中任其生长。

统计分析

MINITABR软件分析实验数据的可靠性,95%置信水平确定数据的显著水平。三次重复实验,两组独立数据用于建立分析模型,一组独立数据用于验证实验数据。

结果和讨论

脉冲紫外光闪照处理流动牛奶变量如下:(1)样品离石英板距离;(2)闪照次数;(3)流量。脉冲紫外光闪照处理后菌体减少量为0.55 log10cfu/ml-7.26 log10cfu/ml(表2)。实验得到完全杀灭金黄色葡萄球菌条件为:(1)样品距离石英板8cm,闪照1次,流量20 ml/min;(2)样品距离石英板11cm,闪照2次,流量20 ml/min

2 响应曲面设计和脉冲紫外光闪照处理牛奶中金黄色葡萄球菌log10减少量

距离

次数

流量

流动指令

Log10减少量a

数据变化设置(实验)

5

1

30

12

1.25±0.07

0.98

5

2

20

7

2.48±0.66

2.11

5

2

40

6

0.77±0.06

0.76

5

3

30

10

2.40±0.01

2.63

8

1

20

4

7.23±0.36b

7.09b

8

1

40

3

0.55±0.27

0.65

8

2

30

8

4.72±0.69

4.48

8

2

30

9

5.87±0.08

5.60

8

2

30

15

4.76±0.35

4.62

8

3

20

2

2.07±0.33

1.56

8

3

40

14

1.36±0.10

1.17

11

1

30

11

0.72±0.18

0.99

11

2

20

13

7.26±0.32b

7.09b

11

2

40

5

0.73±0.26

0.43

11

3

30

1

0.63±0.40

0.48

 

a三组重复实验:两组数据用于模型分析,一组数据用于验证;平均值和标准差已知;平均值用于模型的分析

b完全灭活;多数脉冲辐射后,没有观察到菌体生长

统计数据分析表明,当样品到石英板的距离作为唯一变量时,95%置信水平(P<0.05)具有显著性差异。然而距离与距离之间和闪照次数与次数之间的阈值PP=0.05)稍微偏高,它们分别是0.0530.052

实验能量变化,距离石英板5cm,8cm11cm处的能量分别为1.07 W/cm20.98 W/cm20.80 W/cm2,然而牛奶实际吸收能量未知。通常能量降低与石英板距离升高有关。能量与距离之间存在多项式函数关系,在近距离内它们之间存在线性关系。由于距离和能量之间存在多项式函数关系,离石英板越远辐射到的能量越低。脉冲紫外光是一种指数衰减波,光谱里包含了紫外光,可见光和远红外光。然而本文在近很小范围内研究,因此能量和距离存在多项式关系。延长辐射距离,可能导致能量指数衰减。近距离实验得到了能量与距离之间的多项式关系。研究延长辐射距离时,可能导致能量呈现指数衰减分布。此外,移动石英板时更多能量在传递中损失,只有少部分能量被牛奶吸收。本文研究中,随着初始闪照距离增加,金黄色葡萄球菌吸收能量逐渐减少。与最远距离处相比,中间层吸收的能量更多,损失更少。此外,靠近石英板表面处温度有所增加。因此,靠近石英板表面处温度可能会很高,导致大量沉积物生成,因此减少了能量吸收。8cm处温度比5cm低,因此增加菌体吸收总能量能增加杀菌率。微生物的距离和闪照次数灭菌图类似于Bellshaped图(图3)。本实验中,随着闪照次数增加菌体减少量也增加。牛奶从石英管中流过,脂肪和其它成分可能会沉积在管壁上。此外,随着能量升高石英管壁上的沉积物也有所增加,沉积物会导致部分脉冲紫外光能量损失。因此,建议进一步研究沉积物厚度对脉冲紫外光杀菌影响。一种机制是定期清除管壁上的沉积物,以确保脉冲光能量全部用以杀菌处理。一种方法是增加流量,因此可以增加管内的冲击力,减少混合沉积物,增加紫外光透过率。安装刀片装置,连续不断清除污染物,使其达到理想工作状态。log10减少量随着距离的增加而增加,当达到一定距离时,log10减少量骤降,因此可以得到可变距离范围内菌体最大减少量。当流量为30ml/min,频率为1时,脉冲紫外光对离石英板5cm11cm处的样品进行闪照处理,菌体的减少量分别为1.25 log10 cfu/ml和0.72 log10 cfu/ml(表2)。

3 比较减少log10曲面图(A)次数和距离;(B)流量和距离;(C)流量和距离

 

正如预期,流量越低停留时间越长,吸收能量越多杀菌率就越高(图3B和3C)。20ml/min,30 ml/min和40 ml/min流速分别输送110ml牛奶,它们所用时间分别为5.52min3.68min2.76min

流速影响不显著(P>0.050),闪照次数一定时菌体log10减少量依靠流速控制(P=0.098)。例如,当闪照次数为3次,离石英板得距离为8cm时,脉冲光对流速为20 ml/min40 ml/min牛奶样品进行闪照,菌体减少量分别为2.07 log10 cfu/ml1.36 log10 cfu/ml。然而,在相同条件下单独对牛奶样品进行闪照处理,它们的减少量分别达到7.23 log10 cfu/ml0.55 log10 cfu/ml。低流速样品停留时间最长,表面温度也有所升高。例如,脉冲光对流量为20ml/min,30 ml/min和40 ml/min的样品闪照300s,它们的温度分别升高了36.7℃,27.8℃和21℃。温度升高会有很多沉积物生成。沉积物导致低流速样品中菌体减少量低于预期值。高流量样品由于输入能量比较低,菌体减少量也偏低。中等流速中样品温度上升不是很高,沉积物形成多,菌体吸收能量最多,增加了脉冲光对菌体的杀灭。图3A3C所示闪照次数对杀菌影响不显著(P>0.05)。闪照1次时,低流量样品中菌体log10减少量有所增加,然而闪照次数增加到三次时,流速对菌体log10减少量没有显著性影响。通常增加闪照次数不利于菌体的杀灭。正如前面所讨论,脉冲光缺点之一是闪照后样品会形成沉积物,阻挡紫外光辐射。因此,深入研究沉积物处理机制是非常必要的。随着时间的推移,光能使沉积物脱落,牛奶能吸收到光全部能量。

验证响应曲面

4 验证响应曲面

响应曲面模型

响应曲面模型是将实验数据进行一次线性方程拟合和二次方程拟合。模型中的变量(1)样品离石英板的距离(Dcm),(2)闪照次数(P),(3)流量(Fml/min)。

Log10减少=β0 + β1D + β2P + β3F + β11D2 + β22P2 +β33F2 + β12DP + β13DF + β23PF + ε

3所示为εβ0β1 β2β3β22β12β13,和β23误差系数值。

 用独立数据验证实验模型。实验数据与预实验结果吻合。图4中R20.836表示模型中数据变化量为83.6%

 

3 响应曲线回归系数模型

名称

系数

P

β0

-16.21481

0.26

β1

4.94370

0.03a

β2

3.68625

0.43

β3

0.05371

0.92

β11

-0.21440

0.05

β22

-1.93708

0.05

β33

-0.00377

0.64

β12

-0.10333

0.69

β13

-0.04017

0.16

β23

0.14925

0.10

 

a加粗名称项数值具有显著性

温度测定

牛奶的温度随着脉冲紫外光闪照处理而升高。例如,牛奶到石英板的距离为8cm,流量为30ml/min,脉冲闪照1s60s300s,它们的温度分别升高了1.5℃,5.6℃和27.8℃(图5)。图5所示为单次脉冲紫外光闪照,牛奶温度升高到38℃。尽管温度不是很高,但足以杀灭金黄色葡萄球菌,可以增强脉冲紫外光的杀菌力。牛奶初始温度随着闪照次数的增加而增加(图4)。例如,样品到石英板的距离为5cm,流量为20ml/min,闪照1次,2次和3次,它们最后的温度分别升高22℃,32℃和36℃。温度快速升高会导致牛奶质量改变。因此,排除温度快速升高保护产品质量。本文还研究了增加驻留时间牛奶温度增加变化。恰当紫外光设计系统对巴氏奶辐射后,表面会形成薄薄的一层膜会减少牛奶驻留时间,从而降低温度聚集。

4 脉冲紫外光闪照处理后牛奶平均温度

距离(cm

流速(ml/min

1次

2次

3次

5

20

22

32

36

5

30

27

34

37

5

40

24

33

36

8

20

26

35

39

8

30

27

35

36

8

40

36

47

51

11

20

31

37

41

11

30

30

39

45

11

40

29

39

46

 

 

 

脉冲紫外光处理牛奶温度分布

5 脉冲紫外光处理牛奶温度分布

结尾

本文研究脉冲紫外光处理可作为一种新型杀菌方法。通常脉冲紫外光能有效杀灭牛奶中金黄色葡萄球菌,第二个实验已证实能完全杀灭牛奶中致病菌。多数辐射实验中观察没有菌体生长。脉冲紫外光可以替代传统的杀菌方法,能有效杀灭金黄色葡萄球菌,在牛奶生产加工中应用是一项很好的技术。研究结果表明,脉冲紫外光可应用到商业连续巴氏奶灭菌中。脉冲杀菌设备进行适当设计,使它高渗透率和瞬时杀菌处理成功应用到商业中。此外,脉冲紫外光系统与现有的巴氏杀菌系统组合,生产出更安全的产品。脉冲紫外光对病原体进行闪照处理具有抗热性。需要进一步研究和验证脉冲紫外光处理在工业中的应用。沉积物和精确测量吸收能量等重要影响因素,需要在今后加以解决。